Рис. 1. Общий принцип работы систем рестрикции-модификации. Прицепившийся к бактерии фаг пытается внедрить в нее свою ДНК и заставить клетку производить закодированные в ней белки, из которых будут собираться новые копии этого фага. Если у бактерии имеется эндонуклеаза рестрикции (REase), которая распознает определенный участок фаговой ДНК, то она сделает разрез в этом месте, после чего вирусная ДНК не сможет транскрибироваться. Аналогичные участки собственного генома бактерии защищены от эндонуклеаз при помощи метилирования, за которое отвечает фермент ДНК-метилтрансфераза (MTase). Рисунок из статьи K. Vasu, V. Nagaraja, 2013. Diverse Functions of Restriction-Modification Systems in Addition to Cellular Defense

Бактерии и археи располагают широким арсеналом систем, защищающих их от вирусов, плазмид и мобильных генетических элементов. Американские ученые показали, что по крайней мере две из них, системы CRISPR-Cas и рестрикции-модификации, могут действовать сообща. Система рестрикции-модификации, заточенная на опознание вирусной ДНК по специфическим участкам и внесение разрезов в них, обеспечивает кратковременную защиту. При этом работа эндонуклеаз рестрикции повышает эффективность и более специфической системы CRISPR-Cas, поскольку они облегчают подготовку маленьких кусочков вирусной ДНК для вставки в локус CRISPR.

Прокариоты — бактерии и археи — так же, как и люди, постоянно подвергаются атакам разнообразных вирусов. Естественно, в ходе эволюции у них выработался свой арсенал средств, препятствующих проникновению вирусов в клетку или его размножению внутри нее. В последние годы «иммунитет» прокариот находится под пристальным вниманием микробиологов (тут достаточно вспомнить систему CRISPR-Cas, которую ученым удалось приспособить под свои нужды), но список противовирусных защитных механизмов прокариот продолжает пополняться.

Одной из первых открытых защитных систем прокариот стала система рестрикции-модификации (СР-М, S. E. Luria, M. L. Human, 1952. A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses). Последующие исследования показали, что она есть у более 90% видов прокариот, геномы которых были секвенированы. В состав этой системы входят два основных фермента: эндонуклеаза рестрикции, распознающая некую последовательность и (в наиболее распространенном случае) вносящая в нее разрыв, а также метилтрансфераза, метилирующая ДНК. Распознавание конкретной целевой последовательности длиной в несколько нуклеотидов определяется структурой эндонуклеазы рестрикции. Метилированная ДНК защищена от действия эндонуклеаз, поэтому, не будь метилтрансферазы, эндонуклеаза рестрикции порезала бы собственную бактериальную ДНК и убила бы саму клетку.

Принцип работы этой системы основан на том, что, как правило, ДНК фагов не метилирована, поэтому попавшая в бактериальную клетку фаговая ДНК быстро измельчается эндонуклеазами рестрикции (рис. 1). Стоит отметить, что, хотя у подавляющего большинства фагов геном представлен ДНК, есть некоторое количество вирусов бактерий, геном которых представлен РНК (у архей РНК-содержащие вирусы пока не описаны), и против них используются несколько иные механизмы защиты.

Фаги, в свою очередь, в ходе эволюции «придумали» массу трюков, как ускользнуть от эндонуклеаз рестрикции. Например, благодаря случайным мутациям они могут избавляться от последовательностей, которые узнают эндонуклеазы рестрикции, имеющиеся в распоряжении у бактерии. Фаговая ДНК с такой удачной мутацией получает шанс не быть разрезанной эндонуклеазами сразу же после попадания в клетку. В этом случае метилтрансфераза может по ошибке навесить метильные метки и на нее, защитив от эндонуклеазы рестрикции и геном самого фага, и его потомство, поскольку при удвоении метилированной ДНК метильные метки навешиваются обе цепи. Таким образом потомки удачливого фага оказываются лучше защищены от СР-М и поэтому они получают очевидное эволюционное преимущество.

Защитные системы группы CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами; Cas — это название семейства эндонуклеаз) работают более хитро.

Когда в клетку бактерии или археи (к слову, у архей системы CRISPR-Cas встречаются существенно чаще, чем у бактерий) попадает вирус, специальные белки группы Cas вырезают из его генома кусочек, который вставляется между короткими палиндромными повторами в локус CRISPR. Таким образом клетка пополняет передаваемую по наследству «библиотеку» чужеродных геномов, которые встретились ей и ее предкам. Возникает вопрос: как система CRISPR-Cas отличает инородный генетический материал от своего? Обычно это происходит при помощи специальных мотивов, которые есть только в бактериальной ДНК. Например, такими мотивами могут быть так называемые chi-сайты (L. A. Marraffini, 2015. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes), о которых мы подробнее поговорим ниже. Какие именно кусочки вирусной ДНК вырезаются, до конца не ясно, но ниже мы рассмотрим один любопытный частный случай предпочтительного вырезания ДНК из конкретных участков фагового генома.

Фрагмент вирусной ДНК, вставленный в CRISPR, называют спейсером. Поскольку спейсеры с кусочками генома фагов бактерия встраивает в собственный геном, то эта «память» передается по наследству. Если клетка переживет вторжение вируса, а потом такой же фаг повторно инфицирует ту же клетку или ее потомков, то с соответствующего спейсера будет считана специальная РНК, которая направит нуклеазу (например, Cas9) к фаговой ДНК, и вирусный геном будет уничтожен (рис. 2). Можно провести параллель между иммунологической памятью, действующей в адаптивной иммунной системе позвоночных, и информацией о фагах, с которыми сталкивалась бактерия, в локусах CRISPR.

Рис. 2. Общий принцип работы системы CRISPR-Cas. (1) — схема строения локуса CRISPR, серыми кружочками обозначены короткие палиндромные повторы, цветными стрелками — спейсеры, вырезанные из геномов разных фагов. Вырезание и вставку новых спейсеров осуществляют белки группы Cas. (2) — с локуса CRISPR считываются специальные РНК, часть последовательности которых комплементарна геномной последовательности соответствующего фага, а часть представлена шпилькой (показана черным), необходимой для взаимодействия с белками Cas. За счет комплементарного взаимодействия такие CRISPR-РНК связываются с геномной ДНК фага, пытающегося инфицировать клетку, и привлекают к ней нуклеазы из числа белков Cas (3). В результате фаговая ДНК уничтожается. Рисунок с сайта gesundheitsindustrie-bw.de

Экспериментальные свидетельства о том, что существует функциональная связь между системами рестрикции-модификации и CRISPR-Cas, накапливались в течение последних нескольких лет. Выяснилось, например, что клетки бактерии Streptococcus thermophiles, имеющие спейсеры от фага Φ2972, справлялись с инфекцией намного успешнее, если в них экспрессировалась система рестрикции-модификации, взятая у Lactococcus lactis, по сравнению с клетками, которые тоже имеют спейсеры от этого фага, но лишены активной системы рестрикции-модификации (M. Dupuis et al., 2013. CRISPR-Cas and restriction–modification systems are compatible and increase phage resistance). Но как именно система рестрикции-модификации помогает CRISPR-Cas? Ответу на этот вопрос посвящена недавняя статья американских исследователей, вышедшая в журнале Molecular Cell.

Авторы исследования работали с клетками золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus), в которых экспрессировались компоненты системы CRISPR-Cas, взятые у бактерии Streptococcus pyogenes и вставленные в плазмиду. В предыдущих работах авторы показали, что в этом случае вставка новых спейсеров в локус CRISPR, локализованный на плазмиде, эффективно работает. В качестве пробной системы рестрикции-модификации ученые выбрали родную для Staphylococcus aureus эндонуклеазу рестрикции SauI.

Клетки стафилококка, не имеющие плазмиды с системой CRISPR, заражали фагом ΦNM4γ4. Ученые продемонстрировали, что работающая система SauI действительно на некоторое время защищает клетки от фага. Но в конечном итоге победа оставалась за фагом — через четыре часа после заражения культура стафилококка полностью лизировалась. Более того, ученые показали, что, хотя бактерии некоторое время могли сдерживать вирус, ошибочное метилирование фаговой ДНК все равно происходило. В результате в бактериальной культуре появлялись фаги с метилированными геномами и потому полностью устойчивые к рестрикции.

Могла ли система CRISPR-Cas защитить клетки стафилококка от фага? Какие спейсеры при этом были бы интегрированы в локус CRISPR? Для ответа на эти вопросы исследователи сначала удалили все последовательности в локусе CRISPR (напомним, он находится на отдельной плазмиде), ввели плазмиду с CRSIPR в клетки золотистого стафилококка и заразили их фагом ΦNM4γ4. Также они заразили ΦNM4γ4 клетки стафилококка, в которых была плазмида с системой CRISPR-Cas, но система SauI была инактивирована из-за мутации в гене, кодирующем эндонуклеазу рестрикции. Ни SauI, ни CRISPR-Cas по отдельности не смогли защитить клетки от фага. Однако в культуре клеток, в которых были активны обе защитные системы, динамика роста клеточной популяции при заражении фагом была необычной: вскоре после инфицирования шла фаза роста, однако затем следовал резкий спад численности бактериальных клеток. Тем не менее, через некоторое время стафилококк «возрождался из пепла», и количество клеток в культуре вновь повышалось. Можно предположить, что во время первой фазы роста клетки сопротивлялись фагу с помощью рестрикции, и параллельно в части из них шел процесс вставки новых спейсеров в локусы CRISPR. В конце концов фаг преодолевал первый эшелон обороны (вероятно, становился метилированным), и численность клеток стафилококка резко шла на спад. Но тут в дело вступала система CRISPR-Cas: клетки, успешно получившие спейсеры с фрагментами вирусной ДНК, хотя и остались в меньшинстве, но смогли дать отпор фагу, а их численность вновь пошла вверх. Звучит красиво, но эта гипотеза нуждалась в проверке. Кроме того, оставалось неясным, как две защитные системы влияют друг на друга.

Сравнение последовательностей локусов CRISPR-Cas в клетках показало, что клетки, в которых была активна система SauI, происходила более активная вставка спейсеров. Может быть, дело в том, что столкновение с системой рестрикции-модификации не давало вирусу запустить литический цикл, при котором клетка усиленно синтезирует дочерние вирионы, а потом лизируется? Известно, что система CRISPR-Cas может извлекать спейсеры и из дефектных, инактивированных фаговых геномов. Ученые заразили стафилококки мутантным фагом ΦNM4γ4, неспособным к литическому циклу, однако интенсивность приобретения новых спейсеров это не повысило.

Разгадка оказалась в другом. Дело в том, что продуктом активности эндонуклеазы рестрикции являются фрагменты двуцепочечной ДНК со свободными концами. Системе CRISPR-Cas существенно легче брать спейсеры из линейной ДНК, чем из кольцевой, а именно кольцевой ДНК представлены геномы большинства фагов. Если на конце спейсера различим сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции, то можно предположить, что он был вставлен именно благодаря системе рестрикции-модификации. Авторы работы попробовали отследить, содержат ли спейсеры, интегрированные в CRISPR в клетках с активной SauI, на своих концах сайты узнавания этой эндонуклеазы рестрикции. Как оказалось, в случае SauI вразумительных результатов добиться не удалось. Возможно, это связано с тем, что геном ΦNM4γ4 содержит аж 26 сайтов узнавания SauI, а может быть, дело в том, что этот фермент может вносить разрывы случайным образом. Как бы то ни было, авторы исследования решили переключиться на другую эндонуклеазу рестрикции, BgIII. Геном фага ΦNM4γ4 содержит только один сайт узнавания BgIII.

Ученые ввели гены, кодирующие компоненты системы рестрикции-модификации BgIII, в клетки стафилококка, которые также содержат CRISPR в виде плазмиды, и повторили эксперимент по заражению фагом ΦNM4γ4. Как и в случае с SauI, динамика культуры включала этап первоначального роста, затем резкого спада численности бактерии и новую фазу роста, на которой, вероятно, бактерии, получившие спейсеры из фагового генома и устойчивые к нему, активно делятся. Примечательно, что, если убрать из фага ΦNM4γ4 единственный сайт узнавания BgIII, вторая фаза роста не наступает, по всей видимости, из-за того, что бактерии не могут обзавестись спейсерами из вирусного генома. Зато анализ последовательностей спейсеров в клетках, которые были заражены ΦNM4γ4 дикого типа и присутствовали в культуре на второй фазе роста, убедительно показал: большинство спейсеров происходят из ближайшей окрестности сайта узнавания BgIII. Похоже, система рестрикции-модификации снабжает систему CRISPR фрагментами фагового генома, из которых белки Cas вырезают спейсеры!

Однако, чтобы до конца разобраться, как взаимодействуют системы CRISPR-Cas и рестрикции-модификации, надо ввести еще одно действующее лицо. У грамположительных бактерий (к их числу относится и стафилококк) есть комплекс AddAB, который задействован в репарации и подрезает свободные концы двуцепочечной ДНК. Ранее было установлено, что активность AddAB повышает активность приобретения спейсеров, вырезанных из cos-сайта фага Φ12γ3. При упаковке в вирусную частицу кольцевой геном фага должен быть переведен в линейную форму. Специальный фермент вносит разрыв в участок ДНК, известный как cos-сайт, при этом образуются липкие концы. Таким образом, хотя в вирионе геном фага находится в линейной форме, при попадании в клетку геном может быть легко переведен в кольцевую форму благодаря липким концам, оставшимся после внесения разрыва в cos-сайт (рис. 3). Только что попавший в клетку линейный геном фага, использующего сайт cos для упаковки, часто становится мишенью AddAB, которая начинает кромсать фаговый геном с одного из концов, пока не доходит до стоп-сигнала — особой последовательности, известной как chi-сайт. Как было показано в предыдущих работах, продукты подрезания комплексом AddAB одного из концов фага Φ12γ3, имеющего сайт cos, охотно подхватываются системой CRISPR-Cas, так что активность AddAB дополнительно способствует приобретению новых спейсеров в этом случае.

Рис. 3. Переход генома фага с cos-сайтом из линейной формы в кольцевую возможен благодаря липким концам. Рисунок с сайта sciencedirect.com

Как комплекс AddAB может повлиять на вставку спейсеров, содержащих фрагмент сайта рестрикции? Чтобы ответить на этот вопрос, ученые заразили клетки стафилококка, имеющие системы CRISPR-Cas и BgIII, производным фага Φ12γ3 — фагом Φ12ρ1. Чтобы получить Φ12ρ1, ученые убрали из генома Φ12γ3 все сайты узнавания BgIII, и, кроме одного, несколько расположенных вблизи него chi-сайтов, чтобы оставить больше материала для будущих спейсеров. Если бы сайт узнавания BgIII соседствовал с несколькими chi-сайтами, была бы высока вероятность, что при активности AddAB последовательность между ними превратилась в столь мелкое крошево, что взять спейсеры оттуда было бы невозможно. Ученые проанализировали последовательности спейсеров, полученных после заражения клеток стафилококка с CRISPR-Cas и BgIII фагом Φ12ρ1, в геноме которого имеется сайт cos. Оказалось, что больше всего спейсеров было взято с участка, отделяющего сайт распознавания BgIII в геноме фага от ближайшего chi-сайта! Так что AddAB действительно дополнительно способствует вставке спейсеров с участка, содержащего сайт рестрикции, подрезая его до ближайшего chi-сайта (рис. 4).

Рис. 4. Система рестрикции-модификации вносит двуцепочечные разрывы в геном фага, впрыснувшего свой генетический материал в бактериальную клетку. Благодаря этому фаг не может перейти к литическому циклу. Комплекс AddAB (также известный как RecBCD у грамотрицательных бактерий) дополнительно нарезает фаговую ДНК, которая вставляется в CRISPR. Благодаря этому бактерии становятся устойчивыми даже к фагам с метилированными геномами, которые легко обходят системы рестрикции-модификации. Рисунок из обсуждаемой статьи в Molecular Cell

Интересно, что заражение фагом приводит к вставке спейсеров не только с участков, соседствующих с сайтом рестрикции. Длительное наблюдение за клетками, восстановившимися после первоначального провала в результате преодоления фагом системы рестрикции-модификации, показало, что со временем клетки обзаводятся спейсерами, взятыми из совершенно разных участков вирусного генома.

Тесная кооперация между системами рестрикции-модификации и CRISPR-Cas настолько впечатлила авторов, что они сравнили взаимодействие двух систем с врожденным и адаптивным иммунитетом позвоночных. Врожденные механизмы защиты первыми реагируют на вторжение патогена, но часто не могут до конца с ним справиться. Зато они «подготавливают» к выходу в бой «тяжелую артиллерию» — адаптивный иммунитет, активность которого сопровождается образованием высокоспецифичных антител, которые в большинстве случаев успешно отражают атаку. Остается отметить, что хотя в обсуждаемой работе ученые искусственно добавляли в клетки стафилококка недостающие гены системы рестрикции-модификации, в природе у многих прокариотов есть обе системы сразу. Но, видимо, по каким-то причинам работать с такими организмами неудобно.

Источник: Pascal Maguin, Andrew Varble, Joshua W. Modell, Luciano A. Marraffini. Cleavage of viral DNA by restriction endonucleases stimulates the type II CRISPR-Cas immune response // Molecular Cell. 2022. DOI: 10.1016/j.molcel.2022.01.012.

Елизавета Минина